支原體qpcr法檢測過程及方法詳解

一、核心檢測原理  

以支原體保守基因為靶標，通過特異性引物與熒光探針結合，在實時熒光定量PCR（qPCR）儀中實現(xiàn)擴增與信號監(jiān)測的同步進行。通過Ct值（閾值循環(huán)數(shù)）量化樣本中支原體核酸含量，Ct值<30為陽性，Ct>40或無擴增為陰性。  

二、全流程操作步驟  

樣本采集與預處理  

類型適配：細胞培養(yǎng)上清、血清、培養(yǎng)基、細胞裂解液等樣本需-20℃/-80℃冷凍保存，運輸時使用干冰/冰袋。  

處理關鍵：液體樣本離心收集菌體沉淀；含DNA酶樣本需用專用試劑盒進行DNA提取，避免降解；固體樣本需裂解細胞釋放核酸。  

核酸提取與質(zhì)控  

使用磁珠法或柱提法試劑盒提取DNA，通過分光光度計檢測濃度（≥50ng/μL）與純度（A260/A280≈1.8）。  

反應體系構建  

試劑配制：10μL體系含PCR緩沖液、dNTPs、特異性引物（Tm值50-60℃）、Taq酶、模板DNA及無菌水。  

對照設置：陽性對照（已知支原體DNA）、陰性對照（無支原體樣本）、空白對照（無模板）。  

qPCR擴增與監(jiān)測  

程序設定：預變性95℃/3min，循環(huán)40次（變性95℃/15s→退火55℃/20s→延伸72℃/40s），末段延伸72℃/5min。  

熒光通道：FAM檢測支原體信號，HEX檢測內(nèi)控對照信號，避免假陰性。  

數(shù)據(jù)分析與報告  

系統(tǒng)自動生成擴增曲線，結合陽性/陰性對照判定結果。報告包含樣本Ct值、擴增曲線圖、實驗參數(shù)（儀器型號、試劑批號）及結論，支持電子/紙質(zhì)版交付。  

三、支原體qpcr法檢測技術優(yōu)勢與注意事項  

優(yōu)勢：靈敏度達10²copies/mL，特異性強（避免交叉反應），2-3小時快速出結果，支持批量檢測與定量分析。  

注意事項：防止污染（使用無菌操作臺、分裝試劑）、避免假陽性（滅活樣本需結合培養(yǎng)法驗證）、確保樣本穩(wěn)定性（避免反復凍融）。